次氮基三乙酸-交聯(lián)瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

IMAC NUPharose HP是含次氮基三乙酸（NTA）基團(tuán)的金屬螯合填料，主要用于帶組氨-酸標(biāo)簽（His-tag）蛋白的親和層析。HP為High Performance的縮寫，意為高分辨，微球的平均粒徑為~35μm。IMAC NUPharose HP未螯合金屬離子，用戶可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子后使用，也提供螯合后可直接使用的填料及相應(yīng)的預(yù)裝柱，螯合Ni2+的產(chǎn)品為Ni-NTANUPharose HP。

通過配基修飾過程的優(yōu)化，產(chǎn)品做到了親和力和特異性的平衡：對帶組氨-酸標(biāo)簽蛋白的結(jié)合量大于50 mg/mL的同時，一步純化后樣品純度可達(dá)90%以上。除了組-氨-酸，金屬螯合填料也可與色-氨酸、半胱-氨酸殘基形成配位結(jié)合，因而這款填料也可用于純化不帶標(biāo)簽但含這些氨基酸殘基的蛋白，例如人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。

與亞氨基二乙酸（IDA）配基相比，NTA配基的性能更加均衡，具有如下特點。

l 對螯合劑、還原劑、堿等試劑的耐受性更好。例如樣品中含有1mM EDTA、1~10 mM β-巰基乙醇或5 mM DTT時，可用Ni-NTANUPharose FF正常純化，純化后可用0.1~1 M NaOH清洗。

l 純化過程洗脫液中脫落的金屬離子可低至ppb（10-12）級，脫落的金屬離子相對于目標(biāo)蛋白的摩爾比可低于 0.1。

2 、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，大腸桿菌表達(dá)帶組-氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速；d 剝離金屬離子后 CIP 過程的 pH 穩(wěn)定性

表中為幾款金屬螯合填料對各種溶液環(huán)境的耐受性測試（靜態(tài)結(jié)合載量測試結(jié)果），其中

√表示基本不影響或降低 5%以內(nèi)

!表示略有影響，降低 15%以內(nèi)，可使用

!!表示有影響，降低 30%以內(nèi)，使用需注意

×表示影響大，降低 30~50%，不建議使用

××表示影響很大，降低 50%以上，無法使用

注：a 樣品中直接加入試劑，其中 20 mM TCEP 的影響原因是直接加 TCEP 對 pH 有較大影響， EDTA-2Na 的影響原因是剝離 Ni2+ ；b 填料用試劑處理至少 2 h，清洗后填料的性能。

 3 、金屬螯合親和層析

金屬離子親和層析是基于蛋白質(zhì)分子表面的組氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Cu2+、Ni2+、Zn2 、Co2+和Ca2+形成穩(wěn)定的配位結(jié)合而進(jìn)行生物大分子分離純化的過程。其中，以Ni2+為螯合離子來純化6個組氨-酸組成的標(biāo)簽蛋白最為常見，本說明書也以該體系為例簡要闡述次氮基三乙酸（NTA）基團(tuán)的親和原理（圖1）。

NUPharose基球修飾上NTA配基后，該配體擁有四個配位基團(tuán)，其中一個氮原子和三個氧原子可以與Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數(shù)的八面體結(jié)構(gòu)，剩余的兩個自由配位點可以與溶劑分子或蛋白質(zhì)分子結(jié)合。Ni2+與組氨-酸標(biāo)簽蛋白的兩個組氨-酸殘基的咪唑基團(tuán)配位結(jié)合的過程即為金屬螯合填料與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合過程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標(biāo)蛋白競爭與Ni2+的結(jié)合。降低pH會影響金屬離子與配體的結(jié)合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過程的方式之一，但pH不宜低 4，pH過低會將剝離金屬離子。

金屬離子親和層析過程的非特異性吸附可能會來自離子相互作用、金屬離子與含組氨-酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者通過提高緩沖液的離子強(qiáng)度得到抑制，通常添加500 mM的NaCl；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過程中添加咪唑而除去。經(jīng)過優(yōu)化，可以得到樣品純度和收率均較高的結(jié)果。

IMAC NUPharose HP填料在使用過程中金屬離子掉落量少，可連續(xù)使用多次。當(dāng)填料性能明顯下降后可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳后再生使用。

4 、使用方法參考 

4.1 色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。IMAC NUPharose HP和Ni-NTANUPharose HP的壓縮比為~1.20。為使達(dá)到壓縮比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分?jǐn)?shù)為67%），使用前攪勻。