HE染色實(shí)驗(yàn)的檢測方法

前言

HE染色法，即是蘇木精-伊紅染色法。石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)分別稱為嗜堿性和嗜酸性；若于兩種染料的親和力都不強(qiáng)，則呈中性。一般的組織變化和組織產(chǎn)物都可以通過這一染色法顯示出來。是形態(tài)學(xué)常用的染色方法。

染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

材料與方法

1 材料

1.1 主要試劑

石蠟、無水乙醇、氨水、硫酸鋁鉀、碘酸鈉、冰醋酸、甘油、蘇木素、伊紅

1.2 溶液配制

PBS溶液：600ml的ddH₂O中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g

KH₂PO₄，用HCl調(diào)節(jié)溶液pH至7.4，定容至1L，濾器過濾后，高壓滅菌，室溫保存。

1.3 主要儀器及耗材

正置顯微鏡、恒溫烘箱、石蠟切片機(jī) 、攤片機(jī)、移液器、水浴鍋

數(shù)字切片掃描儀：濱松 NanoZoomer( S210）公司產(chǎn)品

2 方法

2.1樣本包埋與固定

（1）固定：根據(jù)需要取材后置于福爾馬林中固定48小時(shí)后；

（2）洗滌與脫水：將固定后的組織用流水沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)。不同濃度的乙醇逐級(jí)脫水，50%、70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每級(jí)2小時(shí)。70%乙醇中可長期保存；

（3）透明：50%酒精+50%二甲苯中2小時(shí)，純二甲苯兩小時(shí)，再一次純二甲苯兩小時(shí)；

（4）浸蠟：先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時(shí)，再先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬各3小時(shí)左右；

（5）包埋：將浸好蠟的組織塊放入裝有蠟液的容器中，擺好組織塊位置。待石蠟?zāi)毯髮⒅車嘤嗟氖炄コ?，?zhǔn)備切片；

（6）切片：將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4-7μm，然后切片。

2.2  HE染色

（1） 脫蠟：60℃、30min；二甲苯I 10min、二甲苯II 10min ；

（2）水化：將脫蠟后的切片經(jīng)100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、雙蒸水各3min ；

（3）將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，流水沖洗；

（4）1%鹽酸酒精分化0.5-1min；

（5）流水沖洗1小時(shí)后入蒸餾水片刻；

（6）碳酸飽和水溶液反藍(lán)1min后流水沖洗；

（7）入70％和90％酒精中脫水各10min；

（8）入酒精伊紅染色液染色2-3min；。

（9）脫水透明：染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明；

（10）封片：將已透明的切片滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，貼上標(biāo)箋，切片標(biāo)本就可使用；

2.3 圖像采集

通過掃描，采集圖片。

　送樣運(yùn)輸要求：

　　樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運(yùn)輸送樣。

　　切勿固定時(shí)間過長，切勿冷凍結(jié)冰。

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