western抗體孵育時(shí)間您知道嗎

我們來看看不用的老師不同的意見：

老師一：

1. 首先建議仔細(xì)查看抗體試劑的說明書，全面掌握孵育的時(shí)間和溫度等條件，考慮使用同一個(gè)廠家的配套試劑。

2.每一種試劑作用之后的洗滌過程，都需要標(biāo)準(zhǔn)操作，用力過猛或時(shí)間過久可能導(dǎo)致假陰性反應(yīng)，而洗滌時(shí)間過短、沖洗不充分會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。

3.設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控抗原抗體反應(yīng)和顯色的過程，以便分析結(jié)果和過程中可能存在的問題。

老師二：

一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果佳；孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，4度過夜（從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min）。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37度30min-1h，濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。

孵育時(shí)間過長(zhǎng)非特異性條帶顯現(xiàn)的可能增加

老師三：

一抗的孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時(shí)左右。在室溫的條件下，孵育3小時(shí)左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時(shí)左右。如果一抗的濃度過高或者是孵育時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹而出現(xiàn)非特性顯色。

老師四：

western blot 一抗孵育時(shí)間過長(zhǎng)當(dāng)然有影響的，一抗孵育時(shí)間太長(zhǎng)容易導(dǎo)致非特異性吸附加深

一般可以室溫孵育三十分，然后四度過夜。或者選擇室溫孵育2小時(shí)直接二抗。因?yàn)橄茨は慈サ氖俏唇Y(jié)合的抗體，抗體結(jié)合上就不容易洗掉了。洗膜不背景會(huì)深，但洗膜時(shí)間延長(zhǎng)并不能去除背景。